Granatäpple juice för att minska fekal calprotectin nivåer i inflammatorisk tarmsjukdom patienter med hög risk för kliniska återfall: Studieprotokoll för en randomiserad kontrollerad studie

Mål:

Det huvudsakliga syftet med interventionen studie är att utvärdera den eventuella effekten av granatäpple juice konsumtion på att minska FC nivåer i frivilliga som lider av IBD med en hög risk för kliniska återfall.,(aktiv behandling, kontroll) från baslinjen till 12 veckor senare (primärt utfall)

  • (ii)

    undersöker systemiska och mukosala modifieringar av utvalda biokemiska och molekylära inflammatoriska svarsmarkörer i de två grupperna efter 12 veckor av interventionen jämfört med baslinjen (sekundära utfall)

  • (iii)

    utvärderar cirkulerande och urin-ET-härledda metaboliter från regelbunden konsumtion av granatäpplejuice i de två grupperna före och efter ingreppet

  • protokoll och studiedesign

    en översikt över studiedesignen redovisas i fig., 1 och i ANDEDIAGRAMMET (Fig. 2) (se ytterligare fil 1 för checklistan för Ande). Denna interventionsprov med en randomiserad och kontrollerad design är en tvåarmad studie med parallella grupper. Effekterna av aktiv behandling (granatäpplejuice) jämförs med en kontroll (placebo), och patienter med IBD, antingen UC eller CD, i stabil klinisk remission slumpmässigt tilldelas två grupper. Försökspersonerna ges 125 mL två gånger dagligen eller placebo i 12 veckor., Deltagarna uppmanas att samla in sitt avföringsprov före interventionsbesöket och i slutet av interventionen (T2) om de framgångsrikt är inskrivna. Före (t0) och efter ingreppet (t2) samlas biologiska prover (blod, urin och tarmbiopsier). Ett mellanliggande besök sker 6 veckor efter testbesök 1 (t1) för att bedöma eventuella negativa effekter och förändringar av läkemedel eller hälsotillstånd för att säkerställa att deltagarna fortfarande är lämpliga för studien.

    Fig., 1

    Scheme of the study design. IBD inflammatory bowel disease, UC ulcerative colitis, CD Crohn’s disease

    Fig. 2

    Schedule of enrolment, intervention, and assessments in the study., FC fekal calprotectin, TMAO trimethylamine N-oxid, ET ellagitannin, FFQ food frequency questionnaire

    Under ett ingripande, ämnen ombeds att upprätthålla deras kostvanor med en begränsad dagligt intag (150 mL, för ungefär ett glas) av 100% fruktjuicer, fruktnektar, juice och andra drycker. Konsumtion av frukt, sylt, juice och frön rik på ETs (t.ex. hallon, björnbär, jordgubbar, granatäpple, valnötter och kastanjer) eller kosttillskott som innehåller polyfenoler är inte tillåtet under studien.,

    vissa minimala dietrestriktioner införs en dag före provtagningstiderna. Under 24 timmar före provtagningsperioden måste försökspersonerna avstå från att äta måltider som innehåller trimetylamin N-oxid (TMAO, t. ex. fisk och skaldjur) och dess dietprekursorer, Kolin (ägg) och karnitin (rött och bearbetat kött). dietrestriktioner utvidgas till mejeriprodukter, fjäderfä och livsmedel, t. ex. hela livsmedel, som tros påverka TMAO-metabolismen., En provmåltidsplan är följande: kaffe eller te med icke-helkornkakor till frukost, tomatpizza eller flatbread och grönsaker till lunch, pasta eller ris och grönsaker till middag och en eller två frukter med låg ETs som mellanmål.

    Intervention

    en 125 mL dos av antingen granatäpplejuice eller placebo ges två gånger om dagen.,

    placeboformuleringen (vatten, sackaros och citronsyramonohydrat, som tidigare användes i en studie med friska frivilliga utan kliniskt relevanta effekter) är utformad för att matcha fukt (procentandel), kolhydrat (procentandel), total löslig fast substans (grader Brix), titraterbar surhet (procentandel) och energi (kcal) av granatäpplejuice. En daglig dos granatäpplejuice ger uppskattningsvis 300 mg ETs eller högre; ETs är frånvarande i placebo.,

    ren granatäpplejuice från tre olika sorter (underbar, Hicaznar och Mollar de Elche) och granatäpplejuice från koncentrat vid tre olika utspädningar (50%, 75% och 100%) testades av en panel av 20 friska personer före studien. Ett cv. Underbar 100% granatäpplejuice (Gat Foods; M. P. Hefer, Israel) valdes baserat på den sensoriska kvaliteten, inklusive utseende och smak (smak och arom), av de olika testprodukterna.,

    Placebo och granatäpplejuice levereras av Conserve Italia (Bologna, Italien) i en vit juiceförpackning som innehåller 125 mL dryck med drickshalm (Tetra Brik® Aseptic, Tetra Pak, Lund, Sverige). Drycker är förpackade oskiljaktigt och märkta med deltagarens ID-nummer. Dryckerna ges till alla deltagare i två 6-veckors leveranser vid slutet av tilldelningsbesöket (t0) och det mellanliggande besöket (t1). Frivilliga rekommenderas att skaka drycken väl innan de öppnas och att konsumera den som ett mellanmorgon eller mid-afternoon snack.,

    Deltagarna

    Berättigade patienter är asymptomatiska försökspersoner i åldern 18-80 år med UC eller CD (det senare främst omfattar colon sigmoideum och rektum) i stabil klinisk remission (SCCAI, enkel klinisk kolit activity index = 0 för UC patienter, CDAI, CD-aktivitetsindex < 150 för CD-patienter) under minst 3 månader med FC nivåer som är högre än 100 µg/g . Samtidiga stabila terapier för UC (mesalamin, immunmodulatorer och/eller biologiska läkemedel) utan modifieringar under de föregående 3 månaderna är tillåtna., Uteslutningskriterierna är följande: (i) ny användning av steroider (< 2 månader) eller andra experimentella läkemedel (< 3 månader); (ii) användning av antikoagulantia; (iii) probiotisk användning; (iv) graviditet eller amning; (v) känd eller misstänkt överkänslighet mot granatäpplefrukt eller juice; och (vi) allvarliga comorbidities (t .ex. lever -, njur-eller kardiovaskulär sjukdom; blödningsstörningar; psykiska och neurologiska störningar; allvarliga ätstörningar, särskilt anorexia nervosa och bulimia nervosa).,

    data och provsamling

    rekrytering på plats under IBD-patienternas rutinuppföljningsbesök av gastroenterologerna används som en förmånlig metod. Ämnen är också involverade genom identifiering i IBD – patientdatabasen följt av ett telefonsamtal för att planera ett rutinvårdsbesök. Patienterna screenas vid den gastroenterologiska enheten St. Orsola-Malpighi Hospital (Bologna, Italien). Deltagarna måste ge skriftligt informerat samtycke till att delta i studien., För att säkerställa deltagarlojalitet utförs avancerad besöksplanering och konsekvent uppföljning via e-post och SMS-påminnelser av en forskargruppsmedlem under hela rättegången.

    Perifert blod prover samlas in i en BD Vacutainer® K2 EDTA-rör (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) vid tilldelning (t0) och efter 12 veckors intervention (t2) för att isolera perifera mononukleära celler (Pbmc) för transcriptomic analys och plasma för mätningar av inflammatoriska markörer och TMAO och bedömningar av granatäpple ET härrör metaboliter., Plasma separeras genom centrifugering i 10 min vid 1300×g med hjälp av en kyld centrifug utan broms. PBMCs isoleras av SepMate™ – rör (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Kanada) med Lymphoprep™ som ett täthetsgradientmedium . Urinprover samlas också vid samma tidpunkter för utvärderingar av TMAO och pomegranate ET-härledda metaboliter. Plasma, Pbmc och urinprover lagras vid-80 ° C tills analys.

    avföringsprover för FC-dosering samlas inom 24 h före varje endoskopi och lagras vid 2-8 °C tills de analyseras., Patienter genomgår en endoskopisk undersökning vid tilldelning (t0) och efter 12 veckors intervention (t2). Två biopsier tas från sigmoid kolonslimhinnan (upp till 20 cm från analkanten) vid varje tidpunkt. Biopsier stabiliseras omedelbart i RNAlater® (Thermo Fisher Scientific Inc., San Jose, CA, USA) för transkriptomiska utvärderingar eller stabiliseras genom formalinfixering för histologiska bedömningar.

    kostvanor hos försökspersoner utvärderas under inskrivning genom ett semiquantitative food frequency questionnaire (FFQ) för bedömning av kost total antioxidantkapacitet ., Dessutom bedöms livsmedelsintag med en självadministrerad 3-dagars dietrekord, som samlas in av försökspersoner under tre på varandra följande dagar före varje provtagningsdag under interventionsperioden.

    kompatibla patienter är de som konsumerade minst 80% av dryckerna utan avbrott i protokollet i mer än 14 på varandra följande dagar.

    fekal calprotectin dosering

    FC används som en surrogatmarkör för slemhinneinflammation för att förutsäga risken för återfall ., Kvantifiering av FC utförs med immunochromatographic analysen CalFast (Eurospital, Trieste, Italien) enligt tillverkarens protokoll . FC-värden ≥ 100 µg / g anses prediktiva för endoskopisk slemhinneaktivitet såsom tidigare påvisats .

    endoskopisk och histologisk utvärdering

    enligt Mayo endoskopisk subscore används en cutoff ≥ 1 för att diskriminera förekomsten av endoskopisk inflammation vid baslinjen (T0) och efter ingreppet (t2). Histologisk aktivitet görs enligt Geboes betygssystem . En geboes cutoff poäng ≥ 3.,1 antas definiera aktiv histologisk inflammation . När biopsier visar olika grader av aktivitet beaktas den högsta graden av inflammation.

    inflammatoriska markörer

    valda markörindikatorer för systemisk inflammation—interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8, IL-10 och tumörnekrosfaktor α (TNF-α) —mäts på plasmaprover med ett humant Cytokinkit med hög känslighet (R&d Systems Inc. I Minneapolis, MN, USA) med hjälp av en Bio-Plex® MAGPIX™ Multiplex-Läsare (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)., Cytokinnivåer över analysens kvantifieringsgräns analyseras också med hjälp av AlphaLISA – specifika Kit (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA). Dessa analyser utförs med baseline plasma före (t0) och efter ingreppet (t2).

    trimetylamin N-oxid

    TMAO är en aminoxid som alstras från lipidfosfatidylkolin via mikrobiell metabolism i tarmen och är en ny markör för kardiovaskulär risk med potential för bedömning av sjukdomsaktivitet i IBD . Det kvantifieras av UHPLC-MSn i plasma-och urinprov vid tilldelning (t0) och efter ingreppet (t2)., Proverna centrifugeras och de överstående analyseras med hjälp av UHPLC DIONEX Ultimata 3000 utrustade med en TSQ Vantage trippel quadrupole masspektrometer (QqQ-MS/MS, Thermo Fisher Scientific Inc.) utrustad med en uppvärmd-elektrospray joniseringskälla (H – ESI-II; Thermo Fisher Scientific Inc.) som tidigare beskrivits .

    Transkriptomiska utvärderingar

    Total RNA isoleras från biopsier med Rneasy Mini Kit (Qiagen, Hamburg, Tyskland) enligt tillverkarens protokoll., Kvantitativ real-time PCR-analys (qPCR) utförs för att utvärdera uttrycket av nyckelregulatorgener av slemhinneinflammation i IBD med hjälp av CFX Connect™ real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

    Totalt RNA extraheras från PBMC pellets med hjälp av Quick-RNA™ helblod kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Genuttryck profilen analyseras av hela mänskliga genomet microarray technology (Agilent Technologies Inc. Santa Clara, CA, USA)., qPCR-analys utförs för utvalda differentiellt uttryckta mRNAs för att validera mikroarraydata enligt Derlindati et al. .

    Transkriptomiska analyser utförs vid baslinjen (t0) och vid 12 veckor (T2).

    pomegranate et-derived metabolites

    bestämningen av pomegranate ET-derived metabolites utförs i plasmaprover före (t0) och efter ingreppet (t2). Urinutsöndring uppskattas också. Plasmaprover extraheras enligt Mena et al. , medan urinprover centrifugeras, späds ut och filtreras., Proverna genomgår uhplc-MSn-analys (linjär jonfälla MS för identifiering och trippelkvadrupol MS för kvantifieringsändamål).

    Urvalsstorleksberäkning, randomisering och statistisk analys

    provstorleken beräknades med hänsyn till det primära resultatet, dvs. förändringarna i FC-nivåerna vid vecka 12 jämfört med baslinjen. 50 poäng av FC från baslinjevärdet hos minst 70% av patienterna i granatäpplejuice-gruppen och 40% av patienterna i placebogruppen användes för provstorleksberäkningar. Att upptäcka en signifikant skillnad mellan de två grupperna (0.,05 signifikansnivå, dubbelsidig Fishers exakta test) med 80% effekt uppskattas det minsta antalet patienter som ska inkluderas till 30 i ett 2:1-förhållande . Om man antar en 16% – utfallsfrekvens är det nödvändigt att anmäla 36 patienter (24-ämnen som tilldelats granatäpplejuicegruppen och 12 till placebogruppen).

    en randomiseringslista genereras med hjälp av en parallell randomiserad blockdesign genom slumpmässig Allokeringsprogramvara (version 1.0.0) , där deltagarna slumpmässigt tilldelas i permuterade block till en av de två grupperna ., Denna lista är gjord av en kollega som inte är inblandad i ämnesinskrivning och är blind för deltagarna, utredarna/vårdgivarna eller personer som bedömer resultat. Listan randomisering placeras i sekventiellt numrerade och förseglade kuvert; utredaren öppnar kuverten i följd på dagen för inskrivning.

    Intention-to-treat analys används för att hantera deltagardata. Innan någon jämförelse utförs utvärderas normaliteten för det primära resultatet för att välja det lämpligaste statistiska testet., Om data normalt distribueras uttrycks de som genomsnittlig ± standardavvikelse och analyseras med hjälp av allmänna linjära modeller för upprepade åtgärder med post hoc-jämförelser. Om data normalt inte distribueras rapporteras de som median-och interkvartila intervall, och Friedman-testet, med post hoc-parvisa jämförelser (Wilcoxon test och Sign test), utförs., Samma överväganden tillämpas lika på utvalda sekundära resultat (förändringar i cirkulerande inflammatoriska markörer och TMAO-nivåer, förändringar i granatäpple et-härledda metaboliter, transkriptomiska förändringar i tarmmiopsier). Ett gennätverksbaserat tillvägagångssätt används för att integrera de kvantitativa egenskaperna (FC och TMAO-värden, nivåer av inflammatoriska markörer) och de transkriptomiska förändringarna i Pbmc . Dessutom utförs subgruppsanalys för att bedöma potentiella heterogenitetskällor separat som ett resultat av sjukdomstypen (UC, CD)., Denna analysstrategi används för det primära resultatet.

    sekretess för uppgifter

    personlig identitet och all personlig medicinsk information om försökspersonerna är konfidentiella. Varje deltagare tilldelas ett unikt ID-nummer. Intervention och provkodifiering är dolda för både utredare och patienter (dubbelblind studie) och hålls uteslutande av PI. Studiedeltagarnas samtycke erhålls före rättegången., Alla biologiska prover ska förstöras efter analys, vilket anges i det informerade samtycke som ges till ämnena och enligt förfarandena i etikkommittén för St.Orsola-Malpighi Hospital (Bologna, Italien).

    Lämna ett svar

    Din e-postadress kommer inte publiceras. Obligatoriska fält är märkta *