Granaatappelsap te verminderen fecale calprotectin niveaus in inflammatory bowel disease patiënten met een hoog risico van klinische terugval: Studie protocol voor een gerandomiseerde gecontroleerde trial


Doelen

Het belangrijkste doel van de interventie studie is voor het beoordelen van de mogelijke gevolgen van de juice consumptie op het verminderen van FC niveaus in vrijwilligers met IBD met een hoog risico van klinische terugval.,(actieve behandeling, controle) vanaf baseline tot 12 weken later (primaire uitkomst)

  • (ii)

    onderzoek naar de systemische en mucosale modificaties van geselecteerde biochemische en moleculaire ontstekingsresponsmarkers in de twee groepen na 12 weken interventie vergeleken met baseline (secundaire uitkomsten)

  • (iii)

    evaluatie van circulerende en urinaire et-afgeleide metabolieten van regelmatige consumptie van granaatappelsap in de twee groepen voor en na de interventie

  • Protocol en onderzoeksopzet

    een overzicht van de onderzoeksopzet wordt gerapporteerd in fig., 1 en in de geestenkaart (Fig. 2) (Zie aanvullend dossier 1 voor de SPIRIT-checklist). Deze interventieproef met een gerandomiseerd en gecontroleerd ontwerp is een tweearmige studie met parallelle groepen. De effecten van actieve behandeling (granaatappelsap) worden vergeleken met die van een controle (placebo), en patiënten met IBD, UC of CD, in stabiele klinische remissie worden willekeurig toegewezen aan twee groepen. Proefpersonen krijgen tweemaal daags 125 mL behandeling of placebo gedurende 12 weken., Deelnemers wordt gevraagd om hun ontlasting monster te verzamelen voorafgaand aan het pre-interventie bezoek en aan het einde van de interventie (t2) als ze succesvol zijn ingeschreven. Voor (t0) en na de ingreep (t2) worden biologische monsters (bloed, urine en intestinale biopten) verzameld. Een tussentijds bezoek vindt plaats 6 weken na testbezoek 1 (t1) om eventuele nadelige effecten en veranderingen aan medicijnen of gezondheidsstatus te beoordelen om ervoor te zorgen dat de deelnemers nog steeds geschikt zijn voor de studie.

    Fig., 1

    Scheme of the study design. IBD inflammatory bowel disease, UC ulcerative colitis, CD Crohn’s disease

    Fig. 2

    Schedule of enrolment, intervention, and assessments in the study., FC fecale calprotectine, TMAO trimethylamine N-oxide, ET ellagitannine, FFQ food frequency questionnaire

    tijdens de interventie wordt de proefpersonen gevraagd hun voedingsgewoonten te handhaven met een beperkte dagelijkse inname (150 mL, ongeveer één glas) van 100% vruchtensappen, vruchtennectars en vruchtensapdranken. De consumptie van fruit, jam, sappen en zaden rijk aan ETs (bijvoorbeeld frambozen, bramen, aardbeien, granaatappel, walnoten en kastanjes) of voedingssupplementen die polyfenolen bevatten is niet toegestaan tijdens de studie.,

    enkele minimale dieetbeperkingen worden één dag voor de bemonsteringstijden ingevoerd. Gedurende de 24 uur voorafgaand aan de monsterverzamelingsperiode moeten proefpersonen zich onthouden van het eten van maaltijden die trimethylamine-N-oxide (TMAO; bijvoorbeeld vis en schaaldieren) en de voedingsvoorlopercellen, choline (eieren) en carnitine (rood en verwerkt vlees) bevatten; dieetbeperkingen worden uitgebreid tot zuivelproducten, pluimvee en voedingsmiddelen, zoals hele voedingsmiddelen, waarvan wordt aangenomen dat ze het metabolisme van TMAO beïnvloeden ., Een voorbeeld maaltijd plan is als volgt: koffie of thee met niet-volkoren koekjes voor het ontbijt, tomatenpizza of flatbread en groenten voor de lunch, pasta of rijst en groenten bij het diner, en een of twee fruit laag in ETs als snacks.

    interventie

    tweemaal daags een dosis van 125 mL granaatappelsap of placebo.,

    De placeboformulering (water, sucrose en citroenzuurmonohydraat, eerder gebruikt in een studie met gezonde vrijwilligers zonder klinisch relevante effecten ) is ontworpen om overeen te komen met het vochtgehalte (percentage), het koolhydraat (percentage), het totale gehalte aan oplosbare vaste stoffen (graden Brix), de titreerbare zuurgraad (percentage) en de Energie (kCal) van granaatappelsap. Een dagelijkse dosis granaatappelsap levert naar schatting 300 mg ETs of hoger ; ETs zijn afwezig in de placebo.,zuivere granaatappelsappen van drie verschillende cultivars (Wonderful, Hicaznar en Mollar de Elche) en granaatappelsappen uit concentraat in drie verschillende verdunningen (50%, 75% en 100%) werden vóór de studie getest door een panel van 20 gezonde personen. Een cv. Prachtige 100% granaatappelsap (Gat Foods; M. P. Hefer, Israël) werd gekozen op basis van de sensorische kwaliteit, inclusief uiterlijk en smaak (smaak en aroma), van de verschillende testproducten.,

    Placebo en granaatappelsap worden geleverd door Conserve Italia (Bologna, Italië) in een witte sapdoos met 125 mL drank met een rietje (Tetra Brik® Aseptic, Tetra Pak, Lund, Zweden). Dranken zijn zonder onderscheid verpakt en gelabeld met het ID-nummer van de deelnemer. De dranken worden verstrekt aan alle deelnemers in twee 6-weekse voorraden aan het einde van het toewijzingsbezoek (t0) en het tussenbezoek (T1). Vrijwilligers wordt geadviseerd om het drankje goed te schudden voor het openen en om het te consumeren als een halverwege de ochtend of halverwege de middag snack.,

    deelnemers

    in aanmerking komende patiënten zijn asymptomatische patiënten in de leeftijd van 18-80 jaar met UC of CD (de laatste betrof voornamelijk sigmoid colon en rectum) in stabiele klinische remissie (SCCAI, simple clinical colitis activity index = 0 voor UC-patiënten; CDAI, CD activity index < 150 voor CD-patiënten) gedurende ten minste 3 maanden met FC-spiegels hoger dan 100 µg/g . Gelijktijdige stabiele therapieën voor UC (mesalamine, immunomodulatoren en/of biologische geneesmiddelen) zonder wijzigingen in de voorgaande 3 maanden zijn toegestaan., De uitsluitingscriteria zijn als volgt: (i) gebruik van steroïden (< 2 maanden) of andere experimentele drugs (< 3 maanden); (ii) het gebruik van anticoagulantia; (iii) de probiotische gebruik; (iv), zwangerschap of borstvoeding geven; (v) bekende of vermoede overgevoeligheid voor granaatappel fruit of sap; en (vi) ernstige comorbiditeit (bv., lever, nier of hart-en vaatziekten; bloedingen; psychische en neurologische aandoeningen, ernstige eetstoornissen, met name anorexia nervosa en boulimia nervosa) .,

    gegevens en monsterverzameling

    werving ter plaatse tijdens routinematige follow-upbezoeken van IBD-patiënten door de gastro-enterologen wordt als voorkeursbenadering gebruikt. Proefpersonen zijn ook betrokken door identificatie in de IBD patiënten database gevolgd door een telefoontje om een routine-zorgbezoek te plannen. Patiënten worden gescreend in de gastro-enterologische afdeling van het St.Orsola-Malpighi ziekenhuis (Bologna, Italië). Deelnemers moeten schriftelijke geïnformeerde toestemming geven om deel te nemen aan de studie., Om ervoor te zorgen dat deelnemers behouden blijven, worden geavanceerde bezoekplanning en consistente follow-up via e-mail en sms-herinneringen uitgevoerd door een lid van het onderzoeksteam gedurende de hele proef.

    perifeer bloedmonsters worden verzameld in een BD Vacutainer® K2 EDTA buis (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) bij toewijzing (t0) en na 12 weken interventie (t2) om mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC ‘ s) te isoleren voor transcriptomische analyse en plasma voor metingen van ontstekingsmarkers en TMAO en beoordelingen van granaatappel ET-afgeleide metabolieten., Plasma wordt gescheiden door centrifugeren gedurende 10 minuten bij 1300×g met behulp van een gekoelde centrifuge zonder rem. PBMC ‘ s worden geïsoleerd door sepmate™ – buizen (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada) met Lymphoprep™ als een dichtheidsgradiëntmedium . Urinemonsters worden ook verzameld op dezelfde tijdstippen voor evaluaties van TMAO en granaatappel ET-afgeleide metabolieten. Plasma, PBMC’ s en urinemonsters worden bewaard bij − 80 °C tot analyse.

    ontlastingsmonsters voor FC-dosering worden binnen 24 uur vóór elke endoscopie verzameld en bij 2-8 °C bewaard totdat ze zijn onderzocht., Patiënten ondergaan een endoscopisch onderzoek bij toewijzing (t0) en na 12 weken interventie (t2). Twee biopten worden genomen van de sigmoid colon mucosa (tot 20 cm van de anale berm)op elk tijdstip. Biopten worden onmiddellijk gestabiliseerd in RNAlater® (Thermo Fisher Scientific Inc., San Jose, CA, USA) voor transcriptomische evaluaties of gestabiliseerd door formaline fixatie voor histologische beoordelingen.

    voedingsgewoonten van proefpersonen worden tijdens de inschrijving geëvalueerd aan de hand van een semiquantatieve food frequency questionnaire (FFQ) voor de beoordeling van de totale antioxidantcapaciteit via de voeding ., Bovendien worden de voedselinnamen beoordeeld aan de hand van een door de proefpersonen gedurende drie opeenvolgende dagen vóór elke bemonsteringsdag van de interventieperiode zelf toegediende gegevens over de voeding.

    patiënten die ten minste 80% van de dranken hebben geconsumeerd zonder onderbreking van het protocol gedurende meer dan 14 opeenvolgende dagen.

    fecale calprotectinedosering

    FC wordt gebruikt als surrogaatmarker voor slijmvliesontsteking om het risico op recidief te voorspellen ., De kwantificering van FC wordt uitgevoerd met behulp van de immunochromatografische assay CalFast (Eurospital, Trieste, Italië) volgens het Protocol van de fabrikant . FC-waarden ≥ 100 µg / g worden beschouwd als voorspellend voor de mucosale endoscopische activiteit zoals eerder aangetoond .

    endoscopische en histologische evaluatie

    volgens de Mayo endoscopische subscore wordt een cut-off ≥ 1 gebruikt om de aanwezigheid van endoscopische ontsteking te onderscheiden bij baseline (t0) en na de interventie (t2). Histologische activiteit wordt gescoord volgens het Geboes grading system . A geboes cutoff score ≥ 3.,1 wordt verondersteld om actieve histologische ontsteking te definiëren . Wanneer biopten verschillende mate van activiteit vertonen, wordt de hoogste mate van ontsteking overwogen.

    inflammatoire markers

    geselecteerde markerindicatoren voor systemische ontsteking—interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-8, IL-10 en tumornecrosefactor α (TNF-α) —worden gemeten op plasmamonsters met een humane High Sensitivity Cytokine Kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) met behulp van een Bio-Plex ® MAGPIX™ Multiplex Reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)., Cytokinespiegels boven de bepaalbaarheidsgrens van de bepaling worden ook bepaald met behulp van Alfalisa-specifieke kits (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA). Deze analyses worden uitgevoerd met baseline plasma voor (t0) en na de interventie (t2).

    Trimethylamine-N-oxide

    TMAO is een amineoxide dat wordt gegenereerd uit lipidefosfatidylcholine via het microbiële metabolisme in de darm en is een nieuwe marker voor cardiovasculair risico met de mogelijkheid om de ziekteactiviteit bij IBD te beoordelen . Het wordt gekwantificeerd door UHPLC-MSn in plasma-en urinemonsters bij aanvang bij toewijzing (t0) en na interventie (t2)., Monsters worden gecentrifugeerd en de supernatants geanalyseerd met behulp van de UHPLC Dionex Ultimate 3000 uitgerust met een TSQ Vantage triple quadrupole massaspectrometer (QqQ-MS / MS; Thermo Fisher Scientific Inc.) uitgerust met een verwarmde elektrospray ionisatiebron (h-ESI-II; Thermo Fisher Scientific Inc.) zoals eerder beschreven .

    Transcriptomische evaluaties

    totaal RNA wordt geïsoleerd uit biopten met behulp van de RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hamburg, Duitsland) volgens het Protocol van de fabrikant., Kwantitatieve real-time PCR (qPCR) analyse wordt uitgevoerd om de expressie van belangrijke regulerende genen van mucosale ontsteking in IBD te evalueren met behulp van het CFX Connect™ Real-Time PCR detectiesysteem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

    totaal RNA wordt geëxtraheerd uit PBMC-pellets met behulp van de Quick-RNA™ Volbloedkit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Het profiel van de genuitdrukking wordt geanalyseerd door gehele menselijke technologie van genoommicroarray (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA)., qPCR analyse wordt uitgevoerd voor geselecteerde differentieel uitgedrukt mRNAs om de microarray gegevens volgens Derlindati et al te valideren. .

    Transcriptomische analyses worden uitgevoerd bij baseline (t0) en na 12 weken (t2).

    granaatappel ET-afgeleide metabolieten

    de bepaling van granaatappel ET-afgeleide metabolieten wordt uitgevoerd in plasmamonsters vóór (t0) en na de interventie (t2). Ook de uitscheiding via de urine wordt geschat. Plasmamonsters worden geëxtraheerd volgens Mena et al. terwijl urinemonsters worden gecentrifugeerd, verdund en gefilterd., De monsters worden onderworpen aan UHPLC – MSN-analyse (lineaire ionenval MS voor identificatie en triple quadrupole MS voor kwantificeringsdoeleinden).

    berekening van de steekproefomvang, Randomisatie en statistische analyse

    de steekproefomvang werd berekend op basis van het primaire resultaat, d.w.z. de veranderingen in de FC-spiegels in week 12 ten opzichte van de uitgangswaarde. Vijftig punten FC ten opzichte van de uitgangswaarde bij ten minste 70% van de patiënten in de granaatappelsapgroep en 40% van de patiënten in de placebogroep werd gebruikt voor de berekening van de steekproefgrootte. Om een significant verschil tussen de twee groepen te detecteren (0.,5 significantieniveau, tweezijdige Fisher ‘ s exact test) met 80% vermogen, wordt het minimum aantal patiënten dat moet worden ingeschreven geschat op 30 in een 2:1 verhouding . Uitgaande van een uitvalpercentage van 16%, is het noodzakelijk om 36 patiënten in te schrijven (24 proefpersonen toegewezen aan de granaatappelsapgroep en 12 aan de placebogroep).

    een randomisatie lijst wordt gegenereerd met behulp van een parallel gerandomiseerd blok ontwerp door Random Allocation Software (Versie 1.0.0) , waarbij de deelnemers willekeurig worden toegewezen in gepermuteerde blokken aan een van de twee groepen ., Deze lijst is gemaakt door een collega die niet betrokken is bij de onderwerpinschrijving en is verblind voor de deelnemers, onderzoekers/zorgverleners, of personen die de resultaten beoordelen. De lijst randomisatie wordt geplaatst in sequentieel genummerde en verzegelde enveloppen; de onderzoeker opent de enveloppen in volgorde op de dag van inschrijving.

    Intention-to-treat analyse wordt gebruikt om deelnemersgegevens te verwerken. Voordat een vergelijking wordt uitgevoerd, wordt de normaliteit van het primaire resultaat geëvalueerd om de meest geschikte statistische test te kiezen., Als de gegevens normaal worden verspreid, worden ze uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking en geanalyseerd met behulp van algemene lineaire modellen voor herhaalde metingen met post-hocvergelijkingen. Als de gegevens normaal niet worden verspreid, worden ze gerapporteerd als mediaan en interkwartielbereik, en de Friedman-test, met post hoc paarsgewijze vergelijkingen (Wilcoxon-test en Sign-test), wordt uitgevoerd., Dezelfde overwegingen worden eveneens toegepast op geselecteerde secundaire resultaten (veranderingen in circulerende inflammatoire markers en TMAO niveaus, veranderingen in granaatappel ET-afgeleide metabolieten, transcriptomische veranderingen in intestinale biopten). Een gen netwerk-gebaseerde benadering wordt gebruikt voor het integreren van de kwantitatieve eigenschappen (FC en TMAO waarden, niveaus van ontstekingsmarkers) en de transcriptomic veranderingen in PBMC ‘ s . Daarnaast wordt subgroepanalyse uitgevoerd om mogelijke bronnen van heterogeniteit afzonderlijk te beoordelen als gevolg van het ziektetype (UC, CD)., Deze analyse strategie wordt gebruikt voor de primaire uitkomst.

    vertrouwelijkheid van gegevens

    persoonlijke identiteit en alle persoonlijke medische informatie van de proefpersonen zijn vertrouwelijk. Elke deelnemer krijgt een uniek ID-nummer. Interventie en monstercodering zijn verborgen voor zowel onderzoekers als patiënten (dubbelblind onderzoek) en uitsluitend bewaard door de PI. Voorafgaand aan de studie wordt de toestemming van de deelnemers verkregen., Alle biologische specimens moeten worden vernietigd na analyse, zoals aangegeven in de geïnformeerde toestemming gegeven aan de proefpersonen en volgens de procedures van de Ethische Commissie van St.Orsola-Malpighi ziekenhuis (Bologna, Italië).

    Geef een reactie

    Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd. Vereiste velden zijn gemarkeerd met *