Granateple juice for å redusere fekal calprotectin nivåer i inflammatorisk tarmsykdom pasienter med høy risiko for kliniske tilbakefall: Studien protokollen for en randomisert, kontrollert studie

Mål

Den viktigste hensikten med intervensjonen studien er å vurdere den mulige effekten av granateple juice forbruk på å redusere FC nivåer i frivillige som lider av IBD med en høy risiko for kliniske tilbakefall.,(aktiv behandling, kontroll) fra baseline til 12 uker senere (primær utfallet)

  • (ii)

    å undersøke systemisk og mucosal endringer av utvalgte biokjemiske og molekylære inflammatorisk respons markører i de to gruppene etter 12 ukers intervensjon sammenlignet med baseline (sekundære utfall)

  • (iii)

    evaluering av sirkulerende og urin-ET-avledet metabolitter fra vanlige granateple juice forbruk i de to gruppene før og etter intervensjonen

  • – Protokollen og studere design

    En oversikt over studie design er rapportert i Fig., 1 og i ÅNDEN diagram (Fig. 2) (se annen fil 1 for ÅNDEN sjekkliste). Dette intervensjon prøveversjon med en randomisert og kontrollert design er et to-væpnede studie med parallelle grupper. Effekten av aktiv behandling (pomegranate juice) er sammenlignet med dem på en kontroll (placebo), og pasienter med IBD, enten UC-eller CD-plate i stabil klinisk remisjon er randomisert til to grupper. Fag er gitt 125 mL to ganger daglig for behandling eller placebo i 12 uker., Deltakerne blir bedt om å samle avføringen sin prøve før pre-intervensjon besøk, og på slutten av intervensjon (t2) hvis de er vellykket registrert. Før (t0) og etter intervensjonen (t2), biologiske prøver (blod, urin og tarm biopsi) er samlet. En middels besøket finner sted 6 uker etter test besøk 1 (t1) til å vurdere eventuelle bivirkninger og endringer til medisiner eller helsetilstand for å sikre at deltakerne er fortsatt egnet for studiet.

    Fig., 1

    Scheme of the study design. IBD inflammatory bowel disease, UC ulcerative colitis, CD Crohn’s disease

    Fig. 2

    Schedule of enrolment, intervention, and assessments in the study., FC fekal calprotectin, TMAO trimethylamine N-oksid, ET ellagitannin, FFQ mat frekvens spørreskjemaet

    i Løpet av intervensjonen, fag blir bedt om å opprettholde sine kostvaner med en begrenset daglig inntak (150 mL, omtrent ett glass) av 100% frukt juice, frukt, nektar, og frukt juice. Forbruket av frukt, syltetøy, juice, og frø rik i ETs (f.eks., bringebær, bjørnebær, jordbær, granateple, valnøtter, og kastanjer) eller kosttilskudd som inneholder polyfenoler er ikke tillatt i løpet av studiet.,

    Noen minimal kosttilskudd restriksjoner er innført en dag før prøvetaking ganger. I løpet av 24 timer før prøvetaking periode, fag er forpliktet til å avstå fra å spise måltider som inneholder trimethylamine N-oksid (TMAO; f.eks., fisk og skalldyr) og dens kosttilskudd forløpere, kolin (egg), og karnitin (rødt og behandlet kjøtt); kosttilskudd restriksjoner er utvidet til å meieriprodukter, fjørfe, og matvarer, slik som whole foods, som er antatt å påvirke TMAO metabolismen ., Et eksempel på måltid plan er som følger: kaffe eller te med ikke-hel-korn informasjonskapsler for frokost, tomat pizza eller flatbrød og grønnsaker til lunsj, pasta eller ris og grønnsaker til middag, og en eller to frukt lav i ETs som snacks.

    Intervensjon

    En 125 mL dose av enten granateple juice eller placebo er gitt to ganger om dagen.,

    placebo formulering (vann, sukrose, og sitronsyre monohydrat, som tidligere er brukt i en studie med friske frivillige med ingen klinisk relevante effekter ) er designet for å matche fuktighet (prosent), karbohydrater (prosent), totalt løselig tørrstoff innhold (grader Brix), titratable surhet (prosent), og energi (kcal) av granateple juice. En daglig dose av granateple juice gir en estimert 300 mg ETs eller høyere ; ETs er fraværende i placebo.,

    Ren pomegranate juice fra tre forskjellige sortar (Fantastisk, Hicaznar, og Mollar de Elche) og granateple juice fra konsentrat på tre forskjellige fortynninger (50%, 75% og 100%) ble testet ved et panel av 20 friske personer før studien. En cv. Flott 100% granateple juice (Gat Matvarer, M. P. Hefer, Israel) ble valgt basert på sensorisk kvalitet, inkludert utseende og smak (smak og aroma), av forskjellige teste produkter.,

    Placebo og granateple juice er levert av Spare Italia (Bologna, Italia) i en hvit juice boks avløpsvann 125 mL drikke med en drikke halm (Tetra Brik® Steril, Tetra Pak, Lund, Sverige). Drikkevarer er pakket indistinguishably og merket med deltakerens ID-nummer. Drikkevarene er gitt til alle deltakerne i to 6-ukers rekvisita på slutten av tildeling besøk (t0) og middels besøk (t1). Frivillige rådes til å riste drikke godt før du åpner den og til å fordøye det som en mid-morgen eller midt på ettermiddagen snack.,

    Deltakere

    Kvalifisert pasienter er asymptomatiske studiedeltakere i alderen 18-80 år med UC-eller CD (sistnevnte i hovedsak involverer sigmoid kolon og rektum) i stabil klinisk remisjon (SCCAI, enkle kliniske kolitt aktivitet index = 0 for UC pasienter; CDAI, CD-aktivitet indeks < 150 for CD-pasienter) for minst 3 måneder med FC nivåer høyere enn 100 µg/g . Samtidig stabil terapi for UC (mesalamine, immunomodulators, og/eller biologiske legemidler) uten endringer i de foregående 3 månedene er tillatt., Grunnlag for utelukkelse er som følger: (i) de senere bruk av steroider (< 2 måneder) eller andre eksperimentelle medikamenter (< 3 måneder), (ii) bruk av antikoagulantia; (iii) probiotiske bruk; (iv) graviditet eller amming; (v), kjent eller mistenkt overfølsomhet for å pomegranate frukt eller juice; og (vi) alvorlig comorbidities (f.eks., nedsatt lever -, nyre eller hjerte-og karsykdommer; blødning lidelser, psykiske og nevrologiske lidelser, alvorlige spiseforstyrrelser, spesielt anorexia nervosa og bulimia nervosa) .,

    Data og prøvetaking

    På-området rekruttering under IBD pasienter rutinemessig oppfølging besøk av gastroenterologists er brukt som en fortrinnsrett tilnærming. Fag er også involvert gjennom identifikasjon i IBD pasienten database etterfulgt av en samtale for å planlegge en rutine-omsorg besøk. Pasienter er skjermet på Gastroenterological Enhet av St. Orsola-Malpighi Sykehus (Bologna, Italia). Deltakerne må gi skriftlig informert samtykke til å delta i studien., For å sikre deltakeren oppbevaring, avansert besøk planlegging og konsekvent oppfølging via e-post og sms påminnelser er utført av et forskerteam som medlem i hele rettssaken.

    Perifert blod prøver er samlet i en BD Vacutainer® K2 EDTA-rør (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) ved tildeling (t0) og etter 12 ukers intervensjon (t2) for å isolere perifert blod mononukleære celler (PBMCs) for transcriptomic analyse og plasma-for målinger av inflammatoriske markører og TMAO og vurderinger av ET granateple-avledet metabolitter., Plasma er separert ved sentrifugering i 10 min på 1300×g ved hjelp av en nedkjølt sentrifuge uten brems. PBMCs er isolert av SepMate™ rør (STEMCELL Teknologier, Vancouver, BC, Canada) med Lymphoprep™ som en tetthet gradient medium . Urinprøver er også samlet inn på samme tid poeng for evalueringer av TMAO og ET granateple-avledet metabolitter. Plasma, PBMCs, og urinprøver er lagret ved − 80 °C inntil analyse.

    Krakk prøver for FC dosering er hentet innen 24 timer før hver endoskopi og oppbevares ved 2-8 °C til de er analysert., Pasienter gjennomgå en endoskopisk undersøkelse ved tildeling (t0) og etter 12 ukers intervensjon (t2). To biopsi er tatt fra den sigmoid colonic mucosa (opp til 20 cm fra anal kanten) på hvert tidspunkt. Biopsi er umiddelbart stabilisert i RNAlater® (Thermo Fisher Scientific Inc. San Jose, CA, USA) for transcriptomic evalueringer eller stabilisert av formalin fiksering for histologisk vurdering.

    kostvaner av emner er evaluert under innmelding gjennom en kvantitativ mat frekvens questionnaire (FFQ) for vurdering av kosttilskudd total antioksidant kapasitet ., I tillegg, mat inntak vurderes med en selv-administrert 3-dagers kosttilskudd-post, som er samlet inn av fag i løpet av tre dager før hver prøvetaking dag av intervensjon periode.

    Kompatibel pasienter er de som spiste minst 80% av drikkevarer uten avbrudd av protokollen for mer enn 14 dager.

    Fekal calprotectin dosering

    FC brukes som et surrogat markør av slimhinnebetennelse å forutsi risiko for tilbakefall ., Den kvantifisering av FC er utført ved hjelp av immunochromatographic analysen CalFast (Eurospital, Trieste, Italia), i henhold til produsentens protokollen . FC-verdier ≥ 100 µg/g er vurdert til å være logisk av slimhinnene endoskopisk aktivitet som tidligere vist .

    Endoskopisk og histologisk vurdering

    Ifølge Mayo endoskopisk delresultat, en grenseverdi på ≥ 1 brukes til å skille tilstedeværelsen av endoskopisk betennelse ved baseline (t0) og etter intervensjonen (t2). Histologiske aktivitet er scoret i henhold til Geboes karakterskalaen . En Geboes cutoff score ≥ 3.,1 er antatt å definere aktiv histologiske betennelse . Når biopsi viser ulike grader av aktivitet, den høyeste grad av betennelse er vurdert.

    Inflammatoriske markører

    Valgt markør indikatorer for systemisk inflammasjon—interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8, IL-10, og tumor nekrose faktor-α (TNF-α) —er målt på plasmaprøver av et Menneske, Høy Følsomhet Cytokin Kit (R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA) ved hjelp av en Bio-Plex® MAGPIX™ Multiplex-Leser (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)., Cytokin-nivåer over analysen grense for kvantifisering er også analysert ved hjelp av AlphaLISA bestemt kits (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA). Disse analysene er utført med baseline plasma før (t0) og etter intervensjonen (t2).

    Trimethylamine N-oksid

    TMAO er et amin oksid generert fra kosttilskudd lipid fosfatidylkolin av gut mikrobiell metabolisme og er en roman markør for kardiovaskulær risiko med potensial for å vurdere sykdomsaktivitet i IBD . Det er kvantifisert ved UHPLC-MSn i baseline plasma og urin prøver ved tildeling (t0) og etter intervensjonen (t2)., Prøvene er sentrifugerte og supernatants analysert ved hjelp av UHPLC DIONEX Ultimate 3000 utstyrt med en TSQ Vantage trippel quadrupole mass spectrometer (QqQ-MS/MS; Thermo Fisher Scientific Inc.) utstyrt med en oppvarmet-electrospray ionisering kilde (H-ESI-II; Thermo Fisher Scientific Inc.) som tidligere beskrevet .

    Transcriptomic evalueringer

    Total RNA isolert fra biopsi ved hjelp av RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hamburg, Tyskland) i henhold til produsentens protokollen., Kvantitativ real-time PCR (qPCR) analyse er utført for å evaluere uttrykk for viktige regulator gener av slimhinnebetennelse i IBD ved hjelp av CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

    Total RNA er hentet fra PBMC pellets ved hjelp av Quick-RNA™ Hele Blod kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Den genuttrykk profil er analysert av hele det humane genom microarray-teknologi (Agilent Technologies Inc. Santa Clara, CA, USA)., qPCR analysen er utført for utvalgte differentially uttrykt mrnaer å validere microarray data i henhold til Derlindati et al. .

    Transcriptomic analyser er utført ved baseline (t0) og ved 12 uker (t2).

    Granateple ET-avledet metabolitter

    fastsettelse av ET granateple-avledet metabolitter er utført i plasmaprøver før (t0) og etter intervensjonen (t2). Urinutskillelse er også beregnet. Plasma-prøvene er hentet ifølge Mena et al. mens urinprøver er sentrifugerte, utvannet, og filtrert., Prøvene er utsatt for UHPLC-MSn-analyse (lineær ion-felle MS for identifisering og triple quadrupole MS for kvantifisering formål).

    Eksempel størrelse beregning, randomisering, og statistisk analyse

    utvalgsstørrelsen ble beregnet vurderer den primære utfallet, dvs., endringer i FC nivåer i uke 12 sammenlignet med baseline. Femti poeng av FC fra baseline verdi i minst 70% av pasientene i granateple juice gruppe og 40% av pasientene i placebogruppen ble brukt for eksempel størrelse beregninger. Å oppdage en betydelig forskjell mellom de to gruppene (0.,05 betydning nivå, tosidig Fisher ‘ s eksakte test) med 80% strøm minimum antall pasienter til å bli registrert er estimert til 30 i et 2:1 forhold . Forutsatt en 16% slippe ut pris, er det nødvendig å registrere 36 pasienter (24 fag som er tilordnet til granateple juice-gruppen og 12 placebogruppen).

    En randomisering listen er generert ved hjelp av et parallelt randomisert blokkere design med Tilfeldig Fordeling Programvare (versjon 1.0.0) , der deltagerne er tilfeldig fordelt i permuted blokker til en av to grupper ., Denne listen er laget av en kollega som ikke er involvert i emnet innmelding og er blindet for deltakerne, etterforskere/helsepersonell eller personer vurdering av resultater. Listen randomisering er plassert i sekvensielt nummerert og forseglede konvolutter; undersøkeren åpner konvolutter i rekkefølge på dagen for innmelding.

    Intensjon-to-treat analyse brukes til å håndtere deltaker data. Før noen sammenligningen er utført, normalitet av de viktigste resultatet er vurdert til å velge den mest egnede statistiske testen., Hvis dataene er normalfordelt, de er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik og analysert ved hjelp av generelle lineære modeller for gjentatt tiltak med post hoc sammenligninger. Hvis dataene ikke er normalfordelt, de er rapportert som median og interkvartil avstand, og Friedman test, med post hoc parvis sammenlikning (Wilcoxon test og Sign-test), er utført., De samme hensyn anvendes like mye til valgt sekundære utfall (endringer i sirkulerende inflammatoriske markører og TMAO nivåer, endringer i ET granateple-avledet metabolitter, transcriptomic endringer i tarmens biopsi). Et gen nettverksbasert tilnærming er brukt for å integrere de kvantitative egenskaper (FC og TMAO verdier, nivåer av inflammatoriske markører) og transcriptomic endringer i PBMCs . I tillegg, undergruppe analysen er utført for å vurdere potensielle kilder til mangfold separat som et resultat av sykdommen type (UC, CD)., Denne analysen samsvarer er ansatt for den primære utfallet.

    konfidensielle data

    Personlig identitet, og alle personlige medisinske opplysninger av fagene er konfidensielle. Hver deltaker får tildelt et unikt ID-nummer. Intervensjon og prøve kodifisering er skjult, både etterforskere og pasienter (dobbelt-blind studie) og holdt utelukkende av PI. Studien deltakernes samtykke er innhentet før rettssaken., Alle biologiske prøver er å bli ødelagt etter analyse, som angitt i den informert samtykke gitt til fag og i henhold til prosedyrer for Etikk Komité av St. Orsola-Malpighi Sykehus (Bologna, Italia).

    Legg igjen en kommentar

    Din e-postadresse vil ikke bli publisert. Obligatoriske felt er merket med *