Granatapfelsaft zur Senkung des fäkalen Calprotectinspiegels bei Patienten mit entzündlicher Darmerkrankung mit hohem Risiko für einen klinischen Rückfall: Studienprotokoll für eine randomisierte kontrollierte Studie

Ziele

Der Hauptzweck der Interventionsstudie besteht darin, die mögliche Wirkung des Granatapfelsaftkonsums auf die Senkung des FC-Spiegels bei Freiwilligen, die an IBD leiden, mit ein hohes Risiko für einen klinischen Rückfall.,(aktive Behandlung, Kontrolle) vom Ausgangswert bis 12 Wochen später (primärer Ausgang)

  • (ii)

    Untersuchung der systemischen und Schleimhautmodifikationen ausgewählter biochemischer und molekularer Entzündungsreaktionsmarker in den beiden Gruppen nach 12 Wochen des Eingriffs im Vergleich zum Ausgangswert (sekundäre Ergebnisse)

  • (iii)

    Bewertung zirkulierender und urinaler ET-abgeleiteter Metaboliten durch regelmäßigen Granatapfelsaftkonsum in den beiden Gruppen vor und nach dem Eingriff

  • Protokoll-und Studiendesign

    Eine Übersicht über das Studiendesign ist in Abb., 1 und im Geisterdiagramm (Abb. 2) (siehe zusätzliche Datei 1 für die SPIRIT-Checkliste). Diese Interventionsstudie mit randomisiertem und kontrolliertem Design ist eine zweiarmige Studie mit parallelen Gruppen. Die Wirkungen einer aktiven Behandlung (Granatapfelsaft) werden mit denen einer Kontrolle (Placebo) verglichen, und Patienten mit IBD, entweder UC oder CD, in stabiler klinischer Remission werden zufällig zwei Gruppen zugeordnet. Die Probanden erhalten zweimal täglich 125 ml Behandlung oder Placebo für 12 Wochen., Die Teilnehmer werden gebeten, ihre Stuhlprobe vor dem Besuch vor der Intervention und am Ende der Intervention (t2) zu sammeln, wenn sie erfolgreich eingeschrieben sind. Vor (t0) und nach dem Eingriff (t2) werden biologische Proben (Blut -, Urin-und Darmbiopsien) entnommen. Ein Zwischenbesuch findet 6 Wochen nach Testbesuch 1 (t1) statt, um etwaige nachteilige Auswirkungen und Änderungen von Medikamenten oder des Gesundheitszustands zu beurteilen und sicherzustellen, dass die Teilnehmer weiterhin für die Studie geeignet sind.

    Abb., 1

    Scheme of the study design. IBD inflammatory bowel disease, UC ulcerative colitis, CD Crohn’s disease

    Fig. 2

    Schedule of enrolment, intervention, and assessments in the study., FC fecal calprotectin, TMAO trimethylamin N-oxide, ET ellagitannin, FFQ food frequency questionnaire

    Während der Intervention werden die Probanden gebeten, ihre Ernährungsgewohnheiten mit einer begrenzten täglichen Einnahme (150 ml, ungefähr ein Glas) von 100% Fruchtsäften, Fruchtnektaren und Fruchtsaftgetränken aufrechtzuerhalten. Der Verzehr von ETs-reichen Früchten, Marmeladen, Säften und Samen (z. B. Himbeeren, Brombeeren, Erdbeeren, Granatapfel, Walnüssen und Kastanien) oder polyphenolhaltigen Nahrungsergänzungsmitteln ist während der Studie nicht gestattet.,

    Einige minimale diätetische Einschränkungen werden einen Tag vor den Probenahmezeiten eingeführt. Während der 24 Stunden vor der Probenentnahme müssen die Probanden auf Mahlzeiten verzichten, die Trimethylamin-N-Oxid (TMAO; z. B. Fisch und Schalentiere) und seine diätetischen Vorläufer, Cholin (Eier) und Carnitin (rotes und verarbeitetes Fleisch) enthalten; diätetische Einschränkungen werden auf Milchprodukte, Geflügel und Lebensmittel wie Vollwertkost ausgedehnt, von denen angenommen wird, dass sie den TMAO-Stoffwechsel beeinflussen ., Ein Mustermahlzeitplan lautet wie folgt: Kaffee oder Tee mit Nicht-Vollkorn-Keksen zum Frühstück, Tomatenpizza oder Fladenbrot und Gemüse zum Mittagessen, Nudeln oder Reis und Gemüse zum Abendessen und ein oder zwei ETs-arme Früchte als Snacks.

    Eine 125-ml-Dosis von Granatapfelsaft oder Placebo wird zweimal täglich verabreicht.,

    Die Placebo-Formulierung (Wasser, Saccharose und Zitronensäuremonohydrat, die zuvor in einer Studie mit gesunden Probanden ohne klinisch relevante Wirkungen verwendet wurde ) ist so konzipiert, dass sie der Feuchtigkeit (Prozentsatz), dem Kohlenhydrat (Prozentsatz), dem gesamten Gehalt an löslichen Feststoffen (Grad Brix), dem titrierbaren Säuregehalt (Prozentsatz) und der Energie (kcal) von Granatapfelsaft entspricht. Eine tägliche Dosis Granatapfelsaft liefert schätzungsweise 300 mg ETs oder höher ; ETs fehlen im Placebo.,

    Reine Granatapfelsäfte aus drei verschiedenen Sorten (Wonderful, Hicaznar und Mollar de Elche) und Granatapfelsäfte aus Konzentrat in drei verschiedenen Verdünnungen (50%, 75% und 100%) wurden vor der Studie von einem Panel von 20 gesunden Personen getestet. Ein Lebenslauf. Wunderbarer 100% Granatapfelsaft (Gat Foods; M. P. Hefer, Israel) wurde basierend auf der sensorischen Qualität, einschließlich Aussehen und Geschmack (Geschmack und Aroma), der verschiedenen Testprodukte ausgewählt.,

    Placebo und Granatapfelsaft werden von Conserve Italia (Bologna, Italien) in einer weißen Saftbox mit 125 ml Getränk und Trinkhalm (Tetra Brik® Aseptic, Tetra Pak, Lund, Schweden) geliefert. Getränke werden ununterscheidbar verpackt und mit der ID-Nummer des Teilnehmers gekennzeichnet. Die Getränke werden allen Teilnehmern in zwei 6-wöchigen Vorräten am Ende des Zuteilungsbesuchs (t0) und des Zwischenbesuchs (t1) zur Verfügung gestellt. Freiwilligen wird empfohlen, das Getränk vor dem Öffnen gut zu schütteln und es als Vormittags-oder Nachmittagssnack zu konsumieren.,

    Teilnehmer

    Berechtigte Patienten sind asymptomatische Patienten im Alter von 18-80 Jahren mit UC oder CD (letztere betreffen hauptsächlich Sigmoidkolon und Rektum) in stabiler klinischer Remission (SCCAI, simple clinical colitis activity index = 0 für UC-Patienten; CDAI, CD activity index < 150 für CD-Patienten) für mindestens 3 Monate mit FC-Spiegeln über 100 µg/g. Gleichzeitige stabile Therapien für UC (Mesalamin, Immunmodulatoren und/oder biologische Arzneimittel) ohne Modifikationen in den letzten 3 Monaten sind zulässig., Die Ausschlusskriterien lauten wie folgt: (i) kürzliche Anwendung von Steroiden (< 2 Monate) oder anderen experimentellen Arzneimitteln (< 3 Monate); (ii) Verwendung von Antikoagulanzien; (iii) probiotische Anwendung; (iv) Schwangerschaft oder Stillzeit; (v) bekannte oder vermutete Überempfindlichkeit gegen Granatapfelfrucht oder-saft; und (vi) schwere Komorbiditäten (z. B. Leber -, Nieren-oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen; Blutung; störungen; psychische und neurologische Störungen; schwere Essstörungen, insbesondere Anorexia nervosa und Bulimia nervosa) .,

    Daten und Probenentnahme

    Die Rekrutierung vor Ort während der routinemäßigen Nachbeobachtungsbesuche der IBD-Patienten durch die Gastroenterologen wird als bevorzugter Ansatz verwendet. Die Probanden werden auch durch Identifizierung in der IBD-Patientendatenbank beteiligt, gefolgt von einem Anruf, um einen Routinebesuch zu planen. Die Patienten werden in der Gastroenterologischen Abteilung des St. Orsola-Malpighi-Krankenhauses (Bologna, Italien) untersucht. Die Teilnehmer müssen eine schriftliche Einwilligung in Kenntnis setzen, um an der Studie teilzunehmen., Um die Teilnehmerbindung sicherzustellen, werden erweiterte Besuchsplanung und konsistente Nachverfolgung durch E-Mail-und SMS-Erinnerungen von einem Forschungsteammitglied während der gesamten Studie durchgeführt.

    Periphere Blutproben werden in einem BD Vacutainer® K2 EDTA-Röhrchen (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) bei Zuteilung (t0) und nach 12 Wochen Intervention (t2) zur Isolierung peripherer mononukleärer Blutzellen (PBMCs) zur transkriptomischen Analyse und Plasma zur Messung von Entzündungsmarkern und TMAO sowie zur Beurteilung von Granatapfel-ET-abgeleiteten Metaboliten entnommen., Plasma wird durch Zentrifugation für 10 min bei 1300×g unter Verwendung einer gekühlten Zentrifuge ohne Bremse getrennt. PBMC werden durch SepMate™ – Röhrchen (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Kanada) mit Lymphoprep™ als Dichtegradientenmedium isoliert . Urinproben werden auch an den gleichen Zeitpunkten für Bewertungen von TMAO-und Granatapfel-ET-abgeleiteten Metaboliten gesammelt. Plasma -, PBMCs – und Urinproben werden bis zur Analyse bei − 80 °C gelagert.

    Stuhlproben zur FC-Dosierung werden innerhalb von 24 h vor jeder Endoskopie entnommen und bei 2-8 °C gelagert, bis sie assayiert sind., Die Patienten werden bei Zuteilung (t0) und nach 12 Wochen Intervention (t2) einer endoskopischen Untersuchung unterzogen. Zu jedem Zeitpunkt werden zwei Biopsien von der Sigmoidkolonschleimhaut (bis zu 20 cm vom Analrand entfernt) entnommen. Biopsien sind sofort stabilisiert in RNAlater® (Thermo Fisher Scientific, Inc., San Jose, CA, USA) für transkriptomische Bewertungen oder stabilisiert durch Formalinfixierung für histologische Bewertungen.

    Die Ernährungsgewohnheiten der Probanden werden während der Einschreibung über einen semiquantitativen Fragebogen zur Häufigkeit von Nahrungsmitteln (FFQ) zur Bewertung der gesamten antioxidativen Kapazität der Nahrung bewertet ., Darüber hinaus werden die Nahrungsaufnahme mit einer selbst verabreichten 3-tägigen diätetischen Aufzeichnung bewertet, die von den Probanden an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor jedem Stichprobentag des Interventionszeitraums erhoben wird.

    Konforme Patienten sind Patienten, die an mehr als 14 aufeinanderfolgenden Tagen mindestens 80% der Getränke ohne Unterbrechung des Protokolls konsumierten.

    Fäkale Calprotectin-Dosierung

    FC wird als Ersatzmarker für Schleimhautentzündungen verwendet, um das Rückfallrisiko vorherzusagen ., Die Quantifizierung von FC erfolgt unter Verwendung des immunochromatographischen Assays CalFast (Eurospital, Triest, Italien) gemäß dem Herstellerprotokoll . FC-Werte ≥ 100 µg / g gelten als prädiktiv für die endoskopische Aktivität der Schleimhaut, wie zuvor gezeigt .

    Endoskopische und histologische Auswertung

    Gemäß dem endoskopischen Subscore von Mayo wird ein Cutoff ≥ 1 verwendet, um das Vorhandensein endoskopischer Entzündungen zu Studienbeginn (t0) und nach dem Eingriff (t2) zu unterscheiden. Die histologische Aktivität wird nach dem Geboes-Bewertungssystem bewertet . Ein Geboes cutoff-score ≥ 3.,es wird angenommen, dass 1 eine aktive histologische Entzündung definiert . Wenn Biopsien unterschiedliche Aktivitätsgrade zeigen, wird der höchste Entzündungsgrad berücksichtigt.

    Entzündungsmarker

    Ausgewählte Markerindikatoren für systemische Entzündungen-Interleukin (IL) – 1β, IL-6, IL-8, IL-10 und Tumornekrosefaktor α (TNF-α) – werden an Plasmaproben mit einem menschlichen hochempfindlichen Zytokin-Kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA), der mit Hilfe eines Bio-Plex® MAGPIX™ Multiplex-Reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)., Zytokinspiegel oberhalb der Quantifizierungsgrenze des Assays werden ebenfalls mit AlphaLISA-spezifischen Kits (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA). Diese Analysen werden mit Baseline-Plasma vor (t0) und nach dem Eingriff (t2) durchgeführt.

    Trimethylamin-N-Oxid

    TMAO ist ein Aminoxid, das aus dem diätetischen Lipidphosphatidylcholin durch den mikrobiellen Darmstoffwechsel erzeugt wird und ein neuartiger Marker für das kardiovaskuläre Risiko mit Potenzial zur Beurteilung der Krankheitsaktivität bei IBD ist . Es wird durch UHPLC-MSn in Basisplasma-und Urinproben bei Zuteilung (t0) und nach der Intervention (t2) quantifiziert., Die Proben werden zentrifugiert und die überstände analysiert mit der UHPLC DIONEX Ultimate 3000 ausgestattet mit einem TSQ Vantage triple-Quadrupol-Massenspektrometer (QqQ-MS/MS; Thermo Fisher Scientific, Inc.), ausgestattet mit einem beheizten-Elektrospray-ionisationsquelle (H-ESI-II; Thermo Fisher Scientific, Inc.), wie zuvor beschrieben .

    Transkriptomische Auswertungen

    Die gesamte RNA wird mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hamburg, Deutschland) nach Herstellerprotokoll aus Biopsien isoliert., Die quantitative Echtzeit-PCR-Analyse (qPCR) wird durchgeführt, um die Expression von Schlüsselregulatorgenen von Schleimhautentzündungen in IBD mit dem CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) zu bewerten.

    Gesamt-RNA extrahiert aus PBMC pellets mit Hilfe des Quick-RNA™ Vollblut-kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Das Genexpressionsprofil wird von whole human genome microarray technology (Agilent Technologies Inc.) analysiert. Santa Clara, CA, USA)., Die qPCR-Analyse wird für ausgewählte differentiell exprimierte mRNAs durchgeführt, um die Microarray-Daten gemäß Derlindati et al.zu validieren. .

    Transkriptomische Analysen werden zu Studienbeginn (t0) und nach 12 Wochen (t2) durchgeführt.

    Granatapfel ET-abgeleitete Metaboliten

    Die Bestimmung von Granatapfel ET-abgeleiteten Metaboliten erfolgt in Plasmaproben vor (t0) und nach dem Eingriff (t2). Die Harnausscheidung wird ebenfalls geschätzt. Plasma-Proben extrahiert wurden nach Mena et al. , während Urinproben zentrifugiert, verdünnt und filtriert werden., Die Proben werden einer UHPLC-MSn-Analyse unterzogen (lineare Ionenfalle MS zur Identifizierung und dreifache Quadrupol MS zur Quantifizierung).

    Stichprobengrößenberechnung, Randomisierung und statistische Analyse

    Die Stichprobengröße wurde unter Berücksichtigung des primären Ergebnisses berechnet, d. H. Der Änderungen der FC-Spiegel in Woche 12 im Vergleich zum Ausgangswert. Fünfzig FC-Punkte vom Ausgangswert bei mindestens 70% der Patienten in der Granatapfelsaftgruppe und 40% der Patienten in der Placebo-Gruppe wurden für Probengrößenberechnungen verwendet. Um einen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen zu erkennen (0.,05 Signifikanzstufe, zweiseitiger Fisher ‚ s Exact Test) Mit 80% Leistung wird die Mindestanzahl der einzuschreibenden Patienten auf 30 im Verhältnis 2:1 geschätzt . Unter der Annahme einer Drop-out-Rate von 16% müssen 36 Patienten eingeschrieben werden (24 Personen, die der Granatapfelsaftgruppe und 12 der Placebogruppe zugeordnet sind).

    Eine Randomisierungsliste wird unter Verwendung eines parallelen randomisierten Blockdesigns von Random Allocation Software (Version 1.0.0) generiert , wobei die Teilnehmer zufällig in permutierten Blöcken einer der beiden Gruppen zugeordnet werden ., Diese Liste wird von einem Kollegen erstellt, der nicht an der Subjektanmeldung beteiligt ist und den Teilnehmern, Ermittlern/Gesundheitsdienstleistern oder Personen, die die Ergebnisse bewerten, blind gegenübersteht. Die Liste Randomisierung wird in sequentiell nummerierten und versiegelten Umschlägen platziert; der Ermittler öffnet die Umschläge nacheinander am Tag der Einschreibung.

    Intention-to-Treat-Analyse wird verwendet, um Teilnehmerdaten zu behandeln. Bevor ein Vergleich durchgeführt wird, wird die Normalität des primären Ergebnisses bewertet, um den am besten geeigneten statistischen Test auszuwählen., Wenn die Daten normal verteilt sind, werden sie als mittlere ± Standardabweichung ausgedrückt und unter Verwendung allgemeiner linearer Modelle für wiederholte Messungen mit Post-hoc-Vergleichen analysiert. Wenn die Daten nicht normal verteilt sind, werden sie als Median-und Interquartilbereich gemeldet, und der Friedman-Test mit Post-hoc-paarweisen Vergleichen (Wilcoxon-Test und Vorzeichentest) wird durchgeführt., Die gleichen Überlegungen gelten gleichermaßen für ausgewählte sekundäre Ergebnisse (Veränderungen der zirkulierenden Entzündungsmarker und TMAO-Spiegel, Veränderungen der von Granatapfel ET abgeleiteten Metaboliten, transkriptomische Veränderungen der Darmbiopsien). Ein Gen-netzwerkbasierter Ansatz wird zur Integration der quantitativen Merkmale (FC – und TMAO-Werte, Entzündungsmarker) und der transkriptomischen Veränderungen in PBMCs verwendet . Zusätzlich wird eine Untergruppenanalyse durchgeführt, um potenzielle Heterogenitätsquellen als Ergebnis des Krankheitstyps (UC, CD) getrennt zu bewerten., Diese Analysestrategie wird für das primäre Ergebnis verwendet.

    Vertraulichkeit der Daten

    Persönliche Identität und alle persönlichen medizinischen Informationen der Probanden sind vertraulich. Jedem Teilnehmer wird eine eindeutige ID-Nummer zugewiesen. Intervention und Stichprobencodifizierung werden sowohl den Ermittlern als auch den Patienten verborgen (Doppelblindstudie) und ausschließlich vom PI aufbewahrt. Die Zustimmung der Studienteilnehmer wird vor der Studie eingeholt., Alle biologischen Proben sind nach der Analyse zu zerstören, wie in der informierten Zustimmung der Probanden und gemäß den Verfahren der Ethikkommission des St. Orsola-Malpighi-Krankenhauses (Bologna, Italien) angegeben.

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