Granatæble juice for at reducere fækal calprotectin niveauer i inflammatorisk tarmsygdom patienter med en høj risiko for klinisk tilbagefald: Undersøgelse protokol til et randomiseret kontrolleret forsøg

Mål

De vigtigste formål med intervention trial er at vurdere den mulige effekt af granatæble juice forbruget på at reducere FC niveauer i frivillige, der lider af IBD med en høj risiko for klinisk tilbagefald.,(aktiv behandling, kontrol) fra baseline til 12 uger senere (primært resultat)

  • (ii)

    at undersøge den systemiske og slimhinder ændringer af udvalgte biokemiske og molekylær inflammatorisk respons markører i de to grupper efter 12 ugers intervention sammenlignet med baseline (sekundære resultater)

  • (iii)

    evaluering af cirkulerende og urin-ET-metabolitter stammer fra regelmæssig granatæble juice forbrug i de to grupper før og efter intervention

  • Protokol og studere design

    En oversigt over undersøgelsens design er rapporteret i Fig., 1 og i åndeskemaet (Fig. 2) (se yderligere fil 1 For SPIRIT Checklisten). Dette interventionsforsøg med et randomiseret og kontrolleret design er en toarmet undersøgelse med parallelle grupper. Virkningerne af aktiv behandling (granatæblejuice) sammenlignes med virkningerne af en kontrol (placebo), og patienter med IBD, enten UC eller CD, i stabil klinisk remission er tilfældigt tildelt to grupper. Forsøgspersoner får 125 mL to gange daglig behandling eller placebo i 12 uger., Deltagerne bliver bedt om at indsamle deres afføringsprøve inden besøget før interventionen og ved afslutningen af interventionen (t2), hvis de med succes er tilmeldt. Før (t0) og efter interventionen (t2) opsamles biologiske prøver (blod, urin og tarmbiopsier). Et mellemliggende besøg finder sted 6 uger efter testbesøg 1 (T1) for at vurdere eventuelle bivirkninger og ændringer i medicin eller sundhedsstatus for at sikre, at deltagerne stadig er egnede til undersøgelsen.

    Fig., 1

    Scheme of the study design. IBD inflammatory bowel disease, UC ulcerative colitis, CD Crohn’s disease

    Fig. 2

    Schedule of enrolment, intervention, and assessments in the study., FC fækal calprotectin, TMAO trimethylamin-N-oxid, ET ellagitannin, FFQ mad frekvens spørgeskema

    Under interventionen, forsøgspersoner bliver bedt om at opretholde deres kostvaner med en begrænset daglig indtagelse (150 mL, ca. ét glas) af 100% frugtsaft, frugtnektar, juice og drinks. Forbruget af frugt, syltetøj, juice og frø rig på ETs (f.hindbær, brombær, jordbær, granatæble, valnødder og kastanjer) eller kosttilskud, der indeholder polyfenoler, er ikke tilladt under undersøgelsen.,

    nogle minimale kostbegrænsninger introduceres en dag før prøveudtagningstider. I løbet af de 24 timer før prøvetagning periode, fag er forpligtet til at afholde sig fra at spise mad, der indeholder trimethylamin-N-oxid (TMAO; fx, fisk og skaldyr) og dens kosten prækursorer, cholin (æg), og carnitin (rødt og forarbejdet kød); kosten restriktioner er udvidet til at omfatte mælkeprodukter, fjerkræ, og fødevarer, som whole foods, som menes at påvirke TMAO metabolisme ., En prøve kostplan er som følger: kaffe eller te med ikke-fuldkorn cookies til morgenmad, tomat pizza eller fladbrød og grøntsager til frokost, pasta eller ris og grøntsager til aftensmad, og et eller to stykker frugt lave i ETs-som snacks.

    Intervention

    en 125 mL dosis enten granatæblejuice eller placebo gives to gange dagligt.,

    placebo-formulering (vand, sukker og citronsyre, monohydrat, der tidligere blev anvendt i en undersøgelse med raske frivillige med ingen klinisk relevant virkning ) er designet til at matche den fugt (i procent), kulhydrater (i procent), i alt opløseligt tørstof indhold (grader Brix), titrerbar syre (procent), og energi (kcal) granatæble saft. En daglig dosis granatæblejuice giver anslået 300 mg ETs eller højere; ETs er fraværende i placebo.,

    Ren granatæble juice fra tre forskellige sorter (Vidunderlig, Hicaznar, og Mollar de Elche) og granatæble juice fra koncentrat på tre forskellige fortyndinger (50%, 75% og 100%) blev testet af et panel på 20 raske personer, som før undersøgelsen. Et cv. Vidunderlig 100% granatæblejuice (Gat Foods; M. P. Hefer, Israel) blev valgt ud fra den sensoriske kvalitet, herunder udseende og smag (smag og aroma), af de forskellige testprodukter.,

    Placebo og granatæble saft, der er leveret af Spare Italia (Bologna, Italien) i en hvid saft boxen med 125 mL drik med sugerør (Tetra Brik® Aseptisk, Tetra Pak i Lund, Sverige). Drikkevarer pakkes uden forskel og mærkes med deltagerens ID-nummer. Drikkevarer leveres til alle deltagere i to 6-ugers forsyninger ved afslutningen af tildelingsbesøget (t0) og mellembesøget (t1). Frivillige rådes til at ryste drikken godt, før de åbner den og spiser den som en midt om morgenen eller midt på eftermiddagen.,

    Deltagere

    Berettiget patienter er asymptomatiske forsøgspersoner i alderen 18-80 år med UC eller CD (sidstnævnte hovedsageligt involverer sigmoid colon og rectum) i stabil klinisk remission (SCCAI, simple kliniske ulcerosa activity index = 0 for UC patienter; CDAI, CD-activity index < 150 for en CD-patienter) i mindst 3 måneder med FC niveauer højere end 100 µg/g . Samtidig stabile terapier for UC (mesalamin, immunmodulatorer og/eller biologiske lægemidler) uden ændringer i de foregående 3 måneder er tilladt., Udelukkelses-kriterierne er som følger: (i) den seneste tids brug af steroider (< 2 måneder) eller andre eksperimentelle stoffer (< 3 måneder); (ii) brug af antikoagulanter; (iii) probiotiske brug; (iv) graviditet eller amning (v) kendt eller mistanke om overfølsomhed over for granatæbler frugt eller juice; og (vi) alvorlige følgesygdomme (fx, lever, nyre eller hjerte-kar-sygdom; blødningsforstyrrelser; mentale og neurologiske lidelser, alvorlige spiseforstyrrelser, især anorexia nervosa og bulimia nervosa) .,

    data og prøveindsamling

    rekruttering på stedet under IBD-patienters rutinemæssige opfølgningsbesøg hos gastroenterologerne anvendes som en præferentiel tilgang. Emner er også involveret gennem identifikation i IBD-patientdatabasen efterfulgt af et telefonopkald for at planlægge et rutinebesøg. Patienterne screenes på den gastroenterologiske enhed i St. Orsola-Malpighi Hospital (Bologna, Italien). Deltagerne skal give skriftligt informeret samtykke til at deltage i undersøgelsen., For at sikre deltagerens fastholdelse udføres avanceret besøgsplanlægning og konsekvent opfølgning via e-mail og SMS-påmindelser af et forskerteammedlem i hele forsøget.

    Perifert blod prøver, der er indsamlet i en BD Vacutainer® K2 EDTA-rør (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) ved tildeling (t0) og efter 12 ugers intervention (t2) til at isolere perifert blod mononukleære celler (PBMCs) for transcriptomic analyse og plasma-til målinger af inflammatoriske markører og TMAO og vurderinger af ET granatæble-afledte metabolitter., Plasma adskilles ved centrifugering i 10 minutter ved 1300 g g ved anvendelse af en kølet centrifuge uden bremse. Pbmc ‘ er isoleres af SepMate tubes-rør (STEMCELL Technologies, Vancouver, BC, Canada) med Lymphoprep as som et tæthedsgradientmedium . Urinprøver indsamles også på samme tidspunkter for evalueringer af TMAO og granatæble et-afledte metabolitter. Plasma, Pbmc ‘ er og urinprøver opbevares ved − 80 C C indtil analyse.afføringsprøver til FC-dosering opsamles inden for 24 timer før hver endoskopi og opbevares ved 2-8.C, indtil de analyseres., Patienter gennemgår en endoskopisk undersøgelse ved tildeling (t0) og efter 12 ugers intervention (T2). To biopsier tages fra sigmoid colon mucosa (op til 20 cm fra analkanten) på hvert tidspunkt. Biopsier stabiliseres straks i RNAlater® (Thermo Fisher Scientific Inc ., San Jose, CA, USA) til transkriptomiske evalueringer eller stabiliseret ved formalinfiksering til histologiske vurderinger.

    kostvaner hos forsøgspersoner evalueres under tilmelding gennem et semiantiuantitative food fre .uency questionnaireuestionnaire (ff.) til vurdering af den samlede antio .idantkapacitet i kosten., Derudover vurderes fødeindtag med en selvadministreret 3-dages diætrekord, som indsamles af forsøgspersoner i løbet af tre på hinanden følgende dage før hver prøveudtagningsdag i interventionsperioden.

    kompatible patienter er dem, der forbrugte mindst 80% af drikkevarerne uden afbrydelse af protokollen i mere end 14 på hinanden følgende dage.

    fækal calprotectin dosering

    FC bruges som surrogatmarkør for slimhindebetændelse for at forudsige risikoen for tilbagefald ., Kvantificeringen af FC udføres ved anvendelse af det immunokromatografiske assay CalFast (Eurospital, Trieste, Italien) i henhold til producentens protokol . FC-værdier ≥ 100gg / g anses for at være forudsigelige for slimhindeendoskopisk aktivitet som tidligere påvist .

    Endoskopisk og histologisk evaluering

    Ifølge Mayo endoskopisk subscore, en cut-off på ≥ 1 er brugt til at diskriminere tilstedeværelsen af endoskopisk betændelse ved baseline (t0) og efter intervention (t2). Histologisk aktivitet scores i henhold til Geboes-klassificeringssystemet . En Geboes cutoff score ≥ 3.,1 antages at definere aktiv histologisk inflammation . Når biopsier viser forskellige grader af aktivitet, overvejes den højeste grad af betændelse.

    Inflammatoriske markører

    de Valgte markør indikatorer for systemisk inflammation—interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8, IL-10, og tumor necrosis factor α (TNF-α) —er målt på plasma-prøver af et Menneske High Sensitivity Cytokin Kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) ved hjælp af en Bio-Plex® MAGPIX™ Multiplex-Læser (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, amerikas forenede stater)., Cytokinniveauer over assays bestemmelsesgrænse analyseres også ved anvendelse af AlphaLISA-specifikke sæt (Perkin Elmer Inc., MAALTHAM, MA, USA). Disse analyser udføres med baseline plasma før (t0) og efter interventionen (T2).

    Trimethylamin-N-oxid

    TMAO er en amin oxid, der er genereret fra kosten lipid phosphatidylcholin af gut mikrobiel metabolisme og er en ny markør for hjerte-kar-risici, der har potentiale til at vurdere sygdommens aktivitet i IBD . Det kvantificeres ved UHPLC-MSN i plasma-og urinprøver ved baseline ved tildeling (t0) og efter interventionen (T2)., Prøverne centrifugeres, og supernatanterne analyseres ved hjælp af UHPLC Dione.Ultimate 3000 udstyret med et TS. Vantage triple quaduadrupole massespektrometer (MS.;-MS/MS; Thermo Fisher Scientific Inc.) udstyret med en opvarmet elektrospray ioniseringskilde (H-ESI-II; Thermo Fisher Scientific Inc .) som tidligere beskrevet .

    Transkriptomiske evalueringer

    Total RNA isoleres fra biopsier ved hjælp af Rneasy Mini Kit (.iagen, Hamburg, Tyskland) i henhold til producentens protokol., Kvantitativ real-time PCR (qPCR) analysen er udført for at evaluere udtrykket af nøgle regulator gener af slimhindeinflammation i IBD hjælp CFX Connect™ Real-Time PCR-Detection System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, amerikas forenede stater).

    Total RNA ekstraheres fra PBMC pellets ved hjælp af Quick-RNA™ fuldblod kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, amerikas forenede stater) i henhold til producentens instruktioner. Genekspressionsprofilen analyseres af hele det humane genom microarray technology(Agilent Technologies Inc ., Santa Clara, CA, USA)., qPCR-analyse udføres for udvalgte differentielt udtrykte mRNA ‘ er for at validere mikroarray-dataene i henhold til derlindati et al. .

    Transkriptomiske analyser udføres ved baseline (t0) og ved 12 uger (T2).

    granatæble-et-afledte metabolitter

    bestemmelsen af granatæble-et-afledte metabolitter udføres i plasmaprøver før (t0) og efter interventionen (T2). Urinudskillelse estimeres også. Plasmaprøver ekstraheres ifølge Mena et al. , mens urinprøver centrifugeres, fortyndes og filtreres., Prøver underkastes UHPLC – MSN-analyse (lineær ionfælde MS til identifikation og tredobbelt quaduadrupol MS til kvantificeringsformål).

    beregning af stikprøvestørrelse, Randomisering og statistisk analyse

    stikprøvestørrelsen blev beregnet under hensyntagen til det primære resultat, dvs.ændringerne i FC-niveauerne i uge 12 sammenlignet med baseline. Halvtreds point FC fra basisværdien hos mindst 70% af patienterne i granatæblejuice-gruppen og 40% af patienterne i placebogruppen blev anvendt til beregning af prøvestørrelsen. At detektere en signifikant forskel mellem de to grupper (0.,05 signifikansniveau, tosidet Fishers nøjagtige test) med 80% effekt estimeres det mindste antal patienter, der skal tilmeldes, til 30 i et 2:1-forhold . Hvis man antager en frafaldshastighed på 16%, er det nødvendigt at tilmelde 36 patienter (24 forsøgspersoner, der er tildelt granatæblejuice-gruppen og 12 til placebogruppen).

    en randomiseringsliste genereres ved hjælp af et parallelt randomiseret blokdesign af tilfældig Allokeringssoft .are (version 1.0.0) , hvor deltagerne tilfældigt tildeles i permuterede blokke til en af de to grupper ., Denne liste er lavet af en kollega, der ikke er involveret i fagtilmelding og er blindet for deltagerne, efterforskere/sundhedsudbydere eller personer, der vurderer resultater. Listen randomisering er placeret i sekventielt nummererede og forseglede konvolutter; investigator åbner konvolutterne i rækkefølge på dagen for indskrivning.

    Intention-to-treat analyse bruges til at håndtere deltagerdata. Før en sammenligning udføres, vurderes normaliteten af det primære resultat for at vælge den mest hensigtsmæssige statistiske test., Hvis dataene normalt distribueres, udtrykkes de som middel standard standardafvigelse og analyseres ved hjælp af generelle lineære modeller til gentagne mål med post hoc-sammenligninger. Hvis dataene normalt ikke distribueres, rapporteres de som median og interkvartil rækkevidde, og Friedman-testen med post hoc-parvise sammenligninger (testilco .on-test og Tegntest) udføres., De samme overvejelser anvendes ligeledes til udvalgte sekundære resultater (ændringer i cirkulerende inflammatoriske markører og TMAO niveauer, ændringer i granatæble ET-afledte metabolitter, transcriptomic ændringer i intestinal biopsi). En gen netværksbaseret tilgang bruges til at integrere de kvantitative træk (FC og TMAO værdier, niveauer af inflammatoriske markører) og de transkriptomiske ændringer i Pbmc ‘ er . Derudover udføres undergruppeanalyse for at vurdere potentielle kilder til heterogenitet separat som følge af sygdomstypen (UC, CD)., Denne analysestrategi anvendes til det primære resultat.

    fortrolighed af data

    personlig identitet og alle personlige medicinske oplysninger om emnerne er fortrolige. Hver deltager tildeles et unikt ID-nummer. Intervention og prøvekodifikation er skjult for både efterforskere og patienter (dobbeltblind undersøgelse) og opbevares udelukkende af PI. Undersøgelsesdeltagernes samtykke opnås inden forsøget., Alle biologiske prøver skal destrueres efter analyse, som angivet i det informerede samtykke, der er givet til emnerne, og i henhold til procedurerne i det etiske udvalg på St. Orsola-Malpighi Hospital (Bologna, Italien).

    Skriv et svar

    Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret. Krævede felter er markeret med *